DNA的酶切图谱构建与分析

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2.1.1 Puc19的质粒DNA酶切体系:8.7 uldd H2O、4 ul PUC19质粒DNA、1.5 ul 10×Buffer、0.8 ul HindⅢ。2.1.2 按上述的顺序将酶切体系加好,混匀,置于37℃的水浴锅内2h。2.2 制备感受态细胞(无菌条件)

实验七,八 DNA限制酶酶切图谱构建与分析 1. 实验目的和要求

我在生物帮上看到过有介绍限制性内切图谱的视频教程,我觉得讲得挺不错的,你可以找到参考一下啊,构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及

学习和掌握限制性内切酶的特性、酶 解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法.掌握 运用限制性内切酶构建大片段DNA图 谱原理与技术并理解限制性内切酶是 DNA重组技术的关键工具,琼脂糖凝 胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方 法。 2. 相关基础知识

长方形的相当于一个电泳的胶 数字代表切出来片段的大小 选A

限制性核酸内切酶:是一类能识别双 链DNA分子特异性核酸序列的DNA水 解酶。

是体外剪切基因片段的重要工 具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶 以及末端修饰酶等一起称为工具酶。

限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中 重要的工具,而且还可以用于基因组 酶切图谱的鉴定。 1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型与基本特性 3) 同裂酶和同尾酶 4) 核酸限制性内切酶的命名法 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 1) 寄主控制的限制与修饰现象

限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。

各 种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双 链的核酸内切酶,它们以此来限制外源DNA 存在于自身细胞内,但合成这种酶的细胞自 身的DNA不受影响,因为这种细胞还合成了 一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限 制性酶对修饰过的DNA不能起作用。

这种现 象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 2)限制性核酸内切酶的类型及特性

按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同,分为三类:

Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 第一类(I型) 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序, 并在识别点附近的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸 顺序没有专一性,是随机的。

这类限制 性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大,无法用于分析DNA结构或克 隆基因。

这类酶如EcoB、EcoK等。 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核 苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割 双链。

由于这类限制性内切酶的识别和切割 的核苷酸都是专一的。

因此,这种限制性内 切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4 个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以 及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。

II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文 对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴 朝二个方向“读”都完全相同。

这种酶的切 割可以有两种方式: 粘性末端;

是交错切割,结果形成两条单链末端, 这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键, 所以称为粘性末端。

如EcoRI的识别顺序为:

5’…… G’AA|TT_C ……3’

3’…… C_TT|AA’G …… 5’

垂直线表示中心对称轴,从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC或CTTAAG,这就是回文顺序(palindrome)。

_和 ‘表示在双链上交错切割的位置,切割后生成

5’……G

AATTC……3’、

3’……CTTAA

G……5’二个DNA片段,各有

一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键

以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 平头末端:

II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切 割双链,产生平头末端。

例如EcoRV 的识别 位置是:

5’…… GAT’|ATC …… 3’

3’…… CTA’|TAG …… 5’

切割后形成

5’…… GAT

和 ATC …… 3’、

3’…… CTA

和 TAG …… 5’。

这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 第三类( III型)限制性内切酶也有专一 的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识 别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切 割双链。

但这几个核苷酸对不是特异性的。

因此,这种限制性内切酶切割后产生的一 定长度DNA片段,具有各种单链末端。

因此 不能应用于基因克隆。 3) 同裂酶和同尾酶:同裂酶:

有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺 序和切割位置都相同,其差别只在于当 识别顺序中有甲基化的核苷酸时,一种 限制性内切酶可以切割,另一种则不能。

例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是 5’……C’CG_G……3’,如果其中有5’-甲 基胞嘧啶,则只有MspⅡ能够切割。

这 些有相同切点的酶称为同裂酶(同切酶 或异源同工酶)。 同尾酶:

有时两种酶切割序列不完全相同,但却能 产生相同的粘性末端,这类酶被称为同尾 酶,可以通过DNA连接酶将这类末端连接 起来,但原来的酶切位点将被破坏,有时 可能会产生一个新的酶切位点。

如Xba1、 Nhe1、Spe1以及Styl切割的DNA序列不同, 但均给出相同的“CTAG”粘性末端。

这些 粘性末端连接后,以上的酶将不能再切割, 但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点, 即 Bfa1的酶切位点。 4) 限制性核酸内切酶的命名法

? 用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称,如E. coli 用Eco表 示,所以用斜体字。

? 用一个字母代表菌株或型,如流感嗜血菌 Rd菌株用d,即Hind。

? 如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同 的限制与修饰体,则以罗马数字表示,如 HindⅠ, HindⅡ,HindⅢ等。 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度;

(2) DNA的甲基化程度;

(3) 酶切消化反应的温度;

(4) DNA的分子结构;

(5) 溶液中离子浓度及种类;

(6) 缓冲液的 pH值。 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后 能形成带有一定孔隙的固体基质的特性,其 密度取决于琼脂糖的浓度。

在电场的作用下 及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就 可以向阳极迁移。

影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素:DNA分 子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、 碱基组成、嵌入的染料以及电泳缓冲液的组 成。 琼脂糖凝胶的浓度影响给定大小的线状 DNA的迁移率,因此采用不同浓度的凝 胶可以分离不同大小范围的DNA片段。

0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨1-25kb 的片段;

0.5% 的琼脂糖凝胶用于分辨 较大片段的DNA (20-100kb);

对于小 片段的DNA(0.2-2kb) 可用1.5%或更高 浓度的凝胶进行分离。

不过,以上这些

并不是绝对的,因为有时我们需要同时

分离多种分子量相差较大的片段,因此 所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。 EB:即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭 溴盐, (Ethidium Bromide)。

它能够插 入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。

由于EB分子的插入,在紫外光的照射下, 凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光, 易于检测。

可以检测10ng 的DNA。

注意:EB是一种诱变剂,操作时一 定要注意安全操作,必须戴塑料或 乳胶手套。 3. 实验材料与仪器

? λDNA ? 标准分子量片段 marker

? EcoRⅠ,HindⅢ, BamHⅠ and so on 核酸内

切酶(Takara) ? 琼脂糖

? TBE或TAE缓冲液(10×) ? 溴化乙啶染色液(10mg/ml) ? 上样液(10×):0.25% 溴酚兰,40%(W/V)

蔗糖 水溶液或30%的甘油。 EcoR I 酶切位点:G'AATT_C BamHI 酶切位点:G’GATC_C

HindⅢ 酶切位点: A’AGCT_T 酶活性的定义:

一个活性单位(U),是指在50l反应体系 中,37oC的条件下,经过1小时的反应时间, 将1g DNA 完全酶解所需要的酶量。

因为不同的酶所要求的最适反应条件不同, 所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。

一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲 液。

双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲 液问题,一般公司会给用户提供这方面的 信息。 EcoRⅠ/HindⅢ 1*M buffer EcoRⅠ/BamHⅠ 1*K buffer HindⅢ/BamHⅠ 1*K buffer 电泳仪,电泳槽,紫外透射仪, 凝胶成像仪,一次性塑料手套等 4. 实验方法和步骤 酶切反应体系: 总体系 灭菌 ddH2O Buffer λDNA EcoRⅠ20 ul

2ul 3 ug 1 ul

置于37℃水浴酶解2小时。

酶解完成后,分别加 入2l 10倍的上样缓冲液, 然后进行电泳分析。 2) 琼脂糖凝胶的制备

琼脂糖凝胶液的制备:称取0.8g琼脂糖, 置于三角瓶中,加入100ml TBE或TAE 工作液,瓶口倒扣一个小烧杯等,将该 三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。 3)胶板的制备

取有机玻璃内槽,洗净、晾干;

取纸胶 条(宽约1cm),将有机玻璃内槽置于一 水平位置模具上,放好梳子。 将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液,小 心地倒在有机玻璃内槽上,控制灌胶速 度和量,使胶液缓慢地展开,直到在整 个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。

室温下静置30min左右,待凝固完全后, 轻轻拔出梳子,在胶板上即形成相互隔 开的上样孔。

制好胶后将铺胶的有机玻 璃内槽放在含有0.5-1×TAE(Tris-乙酸) 或TBE(Tris-硼酸)工作液的电泳槽中 使用。 4)加样

用微量加样器将上述样品分别加入胶板 的样品孔内。

每加完一个样品,换一个 加样头。

加样时应防止碰坏样品孔周围 的凝胶面以及穿透凝胶底部,本实验样 品孔容量约15~20 l。

1 kb DNA ladder(共10条带): 在第一 个上样孔或最后一个上样孔内加入6l 的 1 kb DNA ladder(50ng/l )。 5)电泳(带上手套操作)

? 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳;

? 建议在80~100V的电压下电泳;

? 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处 停止电泳;

? 将凝胶放入溴化乙啶(EB〕工作液 (0.5g/ml左右)中染色约20min。 为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨 率,电场强度不应高于5V/cm(两电极 间的距离)。

电泳温度视需要而定,对

大分子的分离,以低温较好,也可在室 温下进行。

在琼脂糖凝胶浓度低于0.5% 时,由于胶太稀,最好在4℃进行电泳 以增加凝胶硬度。 6)观察与拍照

在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝 胶。

DNA存在处显示出红色的荧光条带。

紫外光激发30s左右,肉眼可观察到清晰 的条带。

在紫外灯下观察时,应戴上防 护眼镜或有机玻璃防护面罩,避免眼睛 遭受强紫外光损伤。

拍照电泳图谱时, 可采用快速凝胶成象系统。

1、遗传图谱(genetic map)又称连锁图谱(linkage map),它是以具有遗传多态性(在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因,在群体中的出现频率皆高于1%)的遗传标记为“路标”,以遗传学距离(在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率,1%的重组率称为1cM)为图距的基因组图。遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造了条件。意义:6000多个遗传标记已经能够把人的基因组分成6000多个区域,使得连锁分析法可以找到某一致病的或表现型的基因与某一标记邻近(紧密连锁)的证据,这样可把这一基因定位于这一已知区域,再对基因进行分离和研究。对于疾病而言,找基因和分析基因是个关键。第1代标记经典的遗传标记,例如ABO血型位点标记,HLA位点标记。70年中后期,限制性片段长度多态性(RFLP),位点数目大与105,用限制性内切酶特异性切割DNA链,由于DNA的一个“点”上的变异所造成的能切与不能切两种状况,可产生不同长度的片段(等位片段),可用凝胶电泳显示多态性,从片段多态性的信息与疾病表型间的关系进行连锁分析,找到致病基因。如Huntington症。但每次酶切2-3个片段,信息量有限。第2代标记1985年,小卫星中心(minisatellite core)、可变串联重复VNTR(variable number of tandem repeats)可提供不同长度的片段,其重复单位长度为6至12个核苷酸,1989年微卫星标记(microsatellite marker)系统被发现和建立,重复单位长度为2~6个核苷酸,又称简短串联重复(STR)。第3代标记1996年MIT的Lander ES又提出了SNP(single nucleotide polymorphysm)的遗传标记系统。对每一核苷酸突变率为10-9,双等位型标记,在人类基因组中可达到300万个,平均约每1250个碱基对就会有一个。3~4个相邻的标记构成的单倍型(haplotype)就可有8~16种。2、物理图谱(physical map)物理图谱是指有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息,它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。DNA物理图谱是指DNA链的限制性酶切片段的排列顺序,即酶切片段在DNA链上的定位。因限制性内切酶在DNA链上的切口是以特异序列为基础的,核苷酸序列不同的DNA,经酶切后就会产生不同长度的DNA片段,由此而构成独特的酶切图谱。因此,DNA物理图谱是DNA分子结构的特征之一。DNA是很大的分子,由限制酶产生的用于测序反应的DNA片段只是其中的极小部分,这些片段在DNA链中所处的位置关系是应该首先解决的问题,故DNA物理图谱是顺序测定的基础,也可理解为指导DNA测序的蓝图。广义地说,DNA测序从物理图谱制作开始,它是测序工作的第一步。制作DNA物理图谱的方法有多种,这里选择一种常用的简便方法—标记片段的部分酶解法,来说明图谱制作原理。用部分酶解法测定DNA物理图谱包括二个基本步骤:(1)完全降解选择合适的限制性内切酶将待测DNA链(已经标记放射性同位素)完全降解,降解产物经凝胶电泳分离后进行自显影,获得的图谱即为组成该DNA链的酶切片段的数目和大小。(2)部分降解以末端标记使待测DNA的一条链带上示踪同位素,然后用上述相同酶部分降解该DNA链,即通过控制反应条件使DNA链上该酶的切口随机断裂,而避免所有切口断裂的完全降解发生。部分酶解产物同样进行电泳分离及自显影。比较上述二步的自显影图谱,根据片段大小及彼此间的差异即可排出酶切片段在DNA链上的位置。下面是测定某组蛋白基因DNA物理图谱的详细说明。完整的物理图谱应包括人类基因组的不同载体DNA克隆片段重叠群图,大片段限制性内切酶切点图,DNA片段或一特异DNA序列(STS)的路标图,以及基因组中广泛存在的特征型序列(如CpG序列、Alu序列,isochore)等的标记图,人类基因组的细胞遗传学图(即染色体的区、带、亚带,或以染色体长度的百分率定标记),最终在分子水平上与序列图的统一。基本原理是把庞大的无从下手的DNA先“敲碎”,再拼接。以Mb、kb、bp作为图距,以DNA探针的STS(sequence tags site)序列为路标。1998 年完成了具有52,000个序列标签位点(STS),并覆盖人类基因组大部分区域的连续克隆系的物理图谱。构建物理图的一个主要内容是把含有STS对应序列的DNA的克隆片段连接成相互重叠的“片段重叠群(contig)”。用“酵母人工染色体(YAC)作为载体的载有人DNA片段的文库已包含了构建总体覆盖率为100%、具有高度代表性的片段重叠群”,近几年来又发展了可靠性更高的BAC、PAC库或cosmid库等。3、序列图谱随着遗传图谱和物理图谱的完成,测序就成为重中之重的工作。DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱。大规模测序基本策略逐个克隆法对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装(公共领域测序计划)。全基因组鸟枪法在一定作图信息基础上,绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序,利用超级计算机进行组装(美国Celera公司)。基因图谱4、基因图谱基因图谱是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。在人类基因组中鉴别出占具2%~5%长度的全部基因的位置、结构与功能,最主要的方法是通过基因的表达产物mRNA反追到染色体的位置。原理所有生物性状和疾病都是由结构或功能蛋白质决定的,而已知的所有蛋白质都是由mRNA编码的,这样可以把mRNA通过反转录酶合成cDNA或称作EST的部分的cDNA片段,也可根据mRNA的信息人工合成cDNA或cDNA片段,然后,再用这种稳定的cDNA或EST作为“探针”进行分子杂交,鉴别出与转录有关的基因。用PolyA互补的寡聚T或克隆载体的相关序列作为引物对mRNA双端尾侧的几百个bp进行测序得到EST(表达序列标签)。2000年6月,EMBL中EST数量已有4,229,786。[4]基因图谱的意义在于它能有效地反应在正常或受控条件中表达的全基因的时空图。通过这张图可以了解某一基因在不同时间不同组织、不同水平的表达;也可以了解一种组织中不同时间、不同基因中不同水平的表达,还可以了解某一特定时间、不同组织中的不同基因不同水平的表达。人类基因组是一个国际合作项目:表征人类基因组,选择的模式生物的DNA测序和作图,发展基因组研究的新技术,完善人类基因组研究涉及的伦理、法律和社会问题,培训能利用HGP发展起来的这些技术和资源进行生物学研究的科学家,促进人类健康内容来自www.egvchb.cn请勿采集。

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